酵母,如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母,通常用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物,他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物具有很好的相似性,所以是生物模型。
酵母細(xì)胞用于研究基因功能,蛋白質(zhì)相互作用,細(xì)胞通路等,也是大規(guī)模異源蛋白表達(dá)和小分子生產(chǎn)的宿主,在發(fā)酵,釀造和制藥行業(yè)等起著*的作用。涉及酵母的常見的實(shí)驗(yàn)有酵母雙/三雜交系統(tǒng),突變體篩選庫和同源重組,等等。
為什么我們需要酵母感受態(tài)細(xì)胞?
通常,在實(shí)驗(yàn)過程中需外源DNA引入到酵母細(xì)胞。引入基因片段(線性ssDNA或質(zhì)粒)是通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的,具體方法有化學(xué)法,如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。
有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細(xì)胞為開始。勝任力則是指細(xì)胞能吸收游離的細(xì)胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。
二、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
獲得感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)簡單,但許多研究人員在實(shí)現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時(shí) 遇到問題。常見的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細(xì)胞死亡率,或由于無效的感受態(tài)細(xì)胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。
雖然酵母細(xì)胞和大腸桿菌一樣容易生長和轉(zhuǎn)化,但它們需要不同的處理方法來制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣,有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細(xì)胞制備協(xié)議如下:
過夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株,使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細(xì)胞。對于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細(xì)胞,使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來維持質(zhì)粒。
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 - 2 x 107cells/mL,離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞密度可以通過使用分光光度計(jì)在OD600檢測,或者使用血球計(jì)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
沖洗細(xì)胞,重懸于無菌水,離心,棄上清,重復(fù)此步驟兩次以*清洗細(xì)胞。
一次洗完,將細(xì)胞重懸于感受態(tài)細(xì)胞溶液,分裝,大約每管108個(gè)細(xì)胞,每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細(xì)胞。分裝好的管子放于-80°C,供以后實(shí)驗(yàn)使用。
在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。
感受態(tài)細(xì)胞溶液包含濃度的冷凍保護(hù)劑,這些濃度應(yīng)該在你的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化,根據(jù)使用的酵母菌株和細(xì)胞的濃度。標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,這種配方被廣泛應(yīng)用來制備感受它細(xì)胞,也可根據(jù)具體情況進(jìn)行輕微的改變或調(diào)整。